Un nuevo coronavirus es el causante de la neumonía de Wuhan, en China

Resumen

En diciembre de 2019, un grupo de pacientes con neumonía de causa desconocida se relacionó con un mercado mayorista de mariscos en Wuhan, China. Se descubrió un betacoronavirus previamente desconocido mediante el uso de secuenciación imparcial en muestras de pacientes con neumonía. Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se usaron para aislar un nuevo coronavirus, llamado 2019-nCoV, que formó otro clado dentro del subgénero sarbecovirus, la subfamilia Orthocoronavirinae.

A diferencia de MERS-CoV y SARS-CoV, 2019-nCoV es el séptimo miembro de la familia de los coronavirus que infectan a los humanos. La vigilancia mejorada y la investigación adicional están en curso.

Introducción

Los patógenos emergentes y reemergentes son desafíos mundiales para la salud pública. Los coronavirus son virus de ARN envueltos que se distribuyen ampliamente entre humanos, otros mamíferos y aves y que causan enfermedades respiratorias, entéricas, hepáticas y neurológicas. Se conocen seis especies de coronavirus que causan enfermedad en humanos. Cuatro virus - 229E, OC43, NL63 y HKU1 - son prevalentes y típicamente causan síntomas de resfriado común en individuos inmunocompetentes. Las otras dos cepas: el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Medio Oriente (MERS-CoV): son de origen zoonótico y se han relacionado con enfermedades a veces mortales. El SARS-CoV fue el agente causal de los brotes de síndrome respiratorio agudo severo en 2002 y 2003 en la provincia de Guangdong, China. MERS -CoV fue el patógeno responsable de brotes de enfermedades respiratorias graves en 2012 en el Medio Oriente.

Dada la alta prevalencia y la amplia distribución de coronavirus, la gran diversidad genética y la recombinación frecuente de sus genomas, y el aumento de las actividades de relación entre humanos y animales, es probable que nuevos coronavirus emerjan periódicamente en humanos debido a infecciones frecuentes y eventos de contagio ocasionales entre especies.

A fines de diciembre de 2019, varios centros de salud locales informaron grupos de pacientes con neumonía de causa desconocida que estaban vinculados epidemiológicamente a un mercado húmedo mayorista de mariscos y otros animales en Wuhan, provincia de Hubei, China. El 31 de diciembre de 2019, el Centro Chino de Enfermedades Control y Prevención (CDC de China) envió un equipo de respuesta rápida para acompañar a las autoridades sanitarias de la provincia de Hubei y de la ciudad de Wuhan y realizar una investigación epidemiológica y etiológica. Reportamos los resultados de esta investigación, identificando la fuente de los grupos de neumonía, y describimos un nuevo coronavirus detectado en pacientes con neumonía cuyas muestras fueron analizadas por los CDC de China en una etapa temprana del brote. También describimos las características clínicas de la neumonía en dos de estos pacientes.

Métodos de Diagnóstico Viral

Se recogieron cuatro muestras del tracto respiratorio inferior, incluido el líquido de lavado broncoalveolar, de pacientes con neumonía de causa desconocida que fueron identificados en Wuhan el 21 de diciembre de 2019 o más tarde y que habían estado presentes en el mercado de mariscos de Huanan cerca del momento de su presentación clínica. Se recogieron siete muestras de líquido de lavado broncoalveolar de pacientes en hospitales de Beijing con neumonía de causa conocida para servir como muestras de control. La extracción de ácidos nucleicos de muestras clínicas (incluidos los cultivos no infectados que sirvieron como controles negativos) se realizó con un kit de ácido nucleico viral de alta pureza, según lo descrito por el fabricante (Roche). Las muestras de ácido nucleico extraídas se analizaron en busca de virus y bacterias por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando el RespiFinderSmart22kit (PathoFinder BV) y el sistema de PCR en tiempo real LightCycler 480, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se analizaron para detectar 22 agentes patógenos (18 virus y 4 bacterias) como se detalla en el Apéndice Complementario. Además, la secuenciación imparcial de alto rendimiento, descrita anteriormente, se usó para descubrir secuencias microbianas no identificables por los medios descritos anteriormente.

Aislamiento del Virus

Las muestras de líquido de lavado broncoalveolar se recogieron en vasos estériles a los que se añadió medio de transporte de virus. Luego se centrifugaron las muestras para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se inoculó en células epiteliales de las vías respiratorias humanas, que se obtuvieron de muestras de vías respiratorias resecadas de pacientes sometidos a cirugía por cáncer de pulmón y el NGS confirmó que estaban libres de patógenos especiales.

Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se expandieron sobre sustrato de plástico para generar células de paso 1 y posteriormente se colocaron en placas a una densidad de 2,5 x 105 células por pocillo sobre soportes permeables Transwell-COL (12 mm de diámetro). Se generaron cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias humanas en una interfaz aire-líquido durante 4 a 6 semanas para formar cultivos polarizados bien diferenciados que se asemejan al epitelio mucociliar pseudoestratificado in vivo.

Antes de la infección, las superficies apicales de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato; se inocularon 150 μl de sobrenadante de muestras de líquido de lavado broncoalveolar en la superficie apical de los cultivos celulares. Después de una incubación de 2 horas a 37 ° C, el virus no unido se eliminó mediante lavado con 500 μl de solución salina tamponada con fosfato durante 10 minutos; las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se mantuvieron en una interfaz aire-líquido incubada a 37 ° C con 5% de dióxido de carbono. Cada 48 horas, se aplicaron 150 μl de solución salina tamponada con fosfato a las superficies apicales de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas, y después de 10 minutos de incubación a 37 ° C, se recogieron las muestras. Las células de epitelio mucociliar seudoestratificadas se mantuvieron en este entorno; Las muestras apicales se pasaron en un vial diluido 1: 3 a células nuevas. Las células se monitorizaron diariamente con microscopía óptica, para determinar los efectos citopáticos, y con RT-PCR, para detectar la presencia de ácido nucleico viral en el sobrenadante. Después de tres pases, se prepararon muestras apicales y células epiteliales de las vías respiratorias humanas para microscopía electrónica de transmisión.

Microscopio de Transmisión por Electrones

Se recolectó el sobrenadante de cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias humanas que mostraron efectos citopáticos, se inactivó con paraformaldehído al 2% durante al menos 2 horas y se ultracentrifugó en partículas de virus de sedimento. El sobrenadante enriquecido se tiñó negativamente sobre rejillas recubiertas con película para su examen. Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas que muestran efectos citopáticos se recogieron y fijaron con paraformaldehído al 2% - glutaraldehído al 2,5% y luego se fijaron con tetróxido de osmio al 1% deshidratado con etanol de grado incrustado con resina PON812. Se cortaron secciones (80 nm) del bloque de resina y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo, por separado. Las rejillas teñidas negativamente y las secciones ultrafinas se observaron bajo microscopía electrónica de transmisión.

Secuenciación del Genoma Viral

El ARN extraído del líquido de lavado broncoalveolar y los sobrenadantes de cultivo se usaron como plantilla para clonar y secuenciar el genoma. Utilizamos una combinación de secuenciación Illumina y secuenciación de nanoporos para caracterizar el genoma del virus. Las lecturas de secuencia se ensamblaron en mapas contig (un conjunto de segmentos de ADN superpuestos) con el uso del software CLC Genomics, versión 4.6.1 (CLC Bio). Posteriormente se diseñaron cebadores específicos para PCR, y se usó RACE 5 'o 3' (amplificación rápida de los extremos de ADNc) para llenar los huecos del genoma de la secuenciación convencional de Sanger. Estos productos de PCR se purificaron de geles y se secuenciaron con un kit de secuenciación de ciclos BigDye Terminator v3.1 y un analizador genético 3130XL, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La alineación de secuencias múltiples del 2019-nCoV y las secuencias de referencia se realizó con el uso de Muscle. El análisis filogenético de los genomas completos se realizó con RAxML  con 1000 repeticiones de arranque y un modelo general reversible en el tiempo utilizado como modelo de sustitución de nucleótidos.

Pacientes

Tres pacientes adultos presentaron neumonía grave y fueron ingresados ​​en un hospital de Wuhan el 27 de diciembre de 2019. El paciente 1 era una mujer de 49 años, el paciente 2 era un hombre de 61 años y el paciente 3 era un hombre de 32 años. Los perfiles clínicos estaban disponibles para los pacientes 1 y 2. El paciente 1 informó que no tenía afecciones médicas crónicas subyacentes, pero informó fiebre (37°C a 38°C) y tos con molestias en el pecho el 23 de diciembre de 2019. Cuatro días después del inicio de enfermedad, su tos y molestias en el pecho empeoraron, pero la fiebre se redujo; el diagnóstico de neumonía se basó en la tomografía computarizada (TC). Su ocupación era minorista en el mercado mayorista de mariscos. El paciente 2 informó inicialmente fiebre y tos el 20 de diciembre de 2019; la dificultad respiratoria se desarrolló 7 días después del inicio de la enfermedad y empeoró durante los siguientes 2 días, momento en el que se inició la ventilación mecánica. Había visitado con frecuencia el mercado mayorista de mariscos. Los pacientes 1 y 3 se recuperaron y fueron dados de alta del hospital el 16 de enero de 2020. El paciente 2 murió el 9 de enero de 2020. No se obtuvieron muestras de biopsia.

Para determinar si las partículas virales podían visualizarse en células epiteliales de las vías respiratorias humanas infectadas con 2019-nCoV, se examinaron cultivos epiteliales de las vías respiratorias humanas infectados con simulación y 2019-nCoV con microscopía óptica diaria y con microscopía electrónica de transmisión 6 días después de la inoculación. Se observaron efectos citopáticos 96 horas después de la inoculación en capas superficiales de células epiteliales de las vías respiratorias humanas; se observó una falta de batido ciliar con microscopia de luz. No se observaron efectos citopáticos específicos en las líneas celulares Vero E6 y Huh-7 hasta 6 días después de la inoculación.

Las micrografías electrónicas de partículas de nCoV 2019 teñidas negativamente fueron generalmente esféricas con algo de pleomorfismo. El diámetro varió de aproximadamente 60 a 140 nm. Las partículas de virus tenían picos bastante distintivos, de aproximadamente 9 a 12 nm, y daban a los viriones la apariencia de una corona solar. Se encontraron partículas de virus libres extracelulares y cuerpos de inclusión llenos de partículas de virus en vesículas unidas a membrana en el citoplasma en las secciones ultrafinas epiteliales de las vías respiratorias humanas. Esta morfología observada es consistente con la familia Coronaviridae.

Aunque 2019-nCoV es similar a algunos betacoronavirus detectados en murciélagos, es distinto de SARS-CoV y MERS-CoV. Los tres coronavirus 2019-nCoV de Wuhan, junto con dos cepas similares al SARS derivadas de murciélagos, ZC45 y ZXC21, forman un clado distinto en el linaje B del subgénero sarbecovirus. Las cepas de SARS-CoV de humanos y los coronavirus similares a SARS genéticamente similares de murciélagos recolectados del suroeste de China formaron otro clado dentro del subgénero sarbecovirus. Dado que la identidad de secuencia en dominios de replicasa conservados (ORF 1ab) es inferior al 90% entre 2019-nCoV y otros miembros del betacoronavirus, el 2019-nCoV, el probable agente causante de la neumonía viral en Wuhan, es un nuevo betacoronavirus perteneciente al subgénero sarbecovirus de la familia Coronaviridae.

Discusión

Todavía se necesita un mayor desarrollo de métodos precisos y rápidos para identificar patógenos respiratorios desconocidos. Sobre la base del análisis de tres genomas completos obtenidos en este estudio, diseñamos varios kits diagnósticos específicos y sensibles dirigidos a las regiones ORF1ab, N y E del genoma 2019-nCoV para detectar ARN viral en muestras clínicas. Los conjuntos de cebadores y los procedimientos operativos estándar se han compartido con la Organización Mundial de la Salud y están destinados a la vigilancia y detección de la infección por 2019-nCoV a nivel mundial y en China. Datos más recientes muestran la detección de 2019-nCoV en 830 personas en China.

Aunque nuestro estudio no cumple con los postulados de Koch, nuestros análisis proporcionan evidencia que implica 2019-nCoV en el brote de Wuhan. La evidencia adicional para confirmar la importancia etiológica de 2019-nCoV en el brote de Wuhan incluye la identificación de un antígeno 2019-nCoV en el tejido pulmonar de los pacientes mediante análisis inmunohistoquímico, detección de anticuerpos antivirales IgM e IgG en dos muestras de suero de un paciente para demostrar seroconversión y experimentos con animales (monos) para proporcionar evidencia de patogenicidad. De importancia crítica son las investigaciones epidemiológicas para caracterizar los modos de transmisión, el intervalo de reproducción y el espectro clínico resultante de la infección para informar y refinar estrategias que puedan prevenir, controlar y detener la propagación de 2019-nCoV.

El artículo original:

Na Zhu, Dingyu Zhang, Wenling Wang, et al., for the China Novel Coronavirus Investigating and Research Team. A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. January 24, 2020. DOI: 10.1056/NEJMoa2001017

Disponible en: http://bit.ly/2TVf8T0